Long Read Sequenzierung

Sequenzierung langer DNA-Fragmente auf ONT- und PacBio-Plattformen, für die Analyse von komplexen Regionen des Genoms, strukturellen Varianten und Phasing.

Long Read Sequencing liest DNA in sehr langen, zusammenhängenden Abschnitten. Damit werden genomische Regionen für Analysen zugänglich, die sich mit kurzen Reads nur eingeschränkt auflösen lassen.

Repetitive, homologe oder paraloge Sequenzabschnitte stellen die Short-Read-Sequenzierung vor eine besondere Herausforderung. Kurze DNA Fragmente lassen sich nicht immer zweifelsfrei einer bestimmten Position im Genom zuordnen. Die Sequenzierung von langen DNA Fragmenten mittels Long-Read Sequencing löst dieses Problem, indem sie solche Abschnitte in einem Stück überspannen. So kann jedes DNA Fragment eindeutig einer Position im Genom zugeordnet werden.

Long-Read Sequencing lohnt sich insbesondere dann, wenn:

• Strukturelle Varianten zuverlässig erfasst werden sollen
• Varianten in komplexen Regionen des Genoms evaluiert werden sollen
• Varianten einem Allel zugeordnet werden sollen

Das MGZ bietet Long Read Sequencing als Auftragsanalyse auf den Plattformen von Oxford Nanopore Technologies (ONT) und Pacific Biosciences (PacBio) an. Auf beiden Plattformen sind sowohl genomweite- als auch zielgerichtete Analysen möglich.

Das MGZ bietet Long-Read Sequencing auf verschiedenen Plattformen entweder in Form einer Genomsequenzierung (WGS) oder einer zielgerichteten Sequenzierung an.

Nicht jede Fragestellung erfordert dieselbe Technologie. Für die Long-Read Sequenzierung stehen zwei Plattformen zur Verfügung, die sich in Readlänge, Fehlerprofil und den Möglichkeiten spezifische Genomregionen anzureichern unterscheiden.

• Whole Genome Sequencing (ONT): Long-Read-Sequenzierung mit hoher Flexibilität. Ermöglicht zusätzlich den direkten Nachweis bestimmter Basenmodifikationen.
• Whole Genome Sequencing (PacBio): Long-Read-Sequenzierung mit langen, hochgenauen Reads. Geeignet für Strukturvarianten, repetitive Elemente und komplexe Genomregionen.
• Adaptive Sampling (ONT): Die Anreicherung der Zielregion erfolgt direkt während der Sequenzierung. Für DNA-Fragmente, welche nicht Teil der Zielregion sind, wird die Sequenzierung gestoppt. Im Vergleich zum WGS mittels Nanopore Sequenzierung, kann in den Zielregionen eine höhere Coverage erreicht werden.
• PureTarget (PacBio): Amplifikationsfreie Anreicherung definierter Zielregionen. Wahlweise als Carrier Panel, Repeats Panel oder individuelle Custom-Lösung. Im Vergleich zum WGS mittels HiFi Sequenzierung, kann in den Zielregionen eine höhere Coverage erreicht werden.

Besonderheiten des Service

• Modularer Aufbau: buchbar als Gesamtpaket oder in Teilschritten. 
• Plattformwahl nach Fragestellung: Empfehlung der geeigneten Technologie je nach Zielsetzung Ihres Projekts.
• Genomweit und zielgerichtet: Beide Plattformen ermöglichen eine genomweite und zielgerichtete Sequenzierung
• Methylierungsstatus: Nachweis von DNA Methylierung aus nativer DNA
• Fachliche Begleitung: von der Probenberatung über die Sequenzierung bis zur Unterstützung bei Bioinformatik und Interpretation. 
• Diagnostik-Erfahrung: langjährige Expertise aus der genetischen Diagnostik am MGZ. 

Prozess der Auftragssequenzierung – modular buchbar

Sechs aufeinander aufbauende Schritte, die je nach Projektbedarf einzeln oder im Gesamtpaket beauftragt werden können: 

Long-Read Sequencing untertützt ein breites Spektrum an Fragestellungen.

Strukturelle Varianten:
Analyse von Kopienzahlveränderungen, Inversionen, Translokationen und komplexe Rearrangements.

Repeat-Expansionen:
Bestimmung der Länge und Motivstruktur von Tandem-Repeats

Komplexe Regionen des Genoms
Analyse von homologen oder paralogen Regionen sowie von Genen mit Pseudogenen.

Phasing und Haplotypisierung
Zuordnung von Varianten zum jeweiligen Allel über größere Distanzen hinweg.

De-novo-Assembly
Rekonstruktion zusammenhängender Genomabschnitte.

Genomweite vs. Zielgerichtete Analyse
Eine genomweite Analyse liefert genetische Informationen über das gesamte Genom. Zielt eine Fragestellung auf wenige, dafür anspruchsvolle Regionen, kann eine zielgerichtete Analyse sinnvoller sein:

• Höhere Abdeckung: Die Sequenzierleistung konzentriert sich auf die definierten Zielregionen.
• Kleinere Datenmengen: Auswertung, Übergabe und Datenhaltung bleiben überschaubar.

Material- und Sequenzieranforderungen richten sich nach der gewählten Plattform und der geplanten Downstream-Analyse.

Sie können uns entweder biologisches Ausgangsmaterial (Blut) oder bereits extrahierte DNA zusenden.  

• Biologisches Ausgangsmaterial: Das MGZ übernimmt die DNA-Extraktion mit einem für die geplante Downstream-Analyse geeigneten Extraktionsverfahren.
• Bereits extrahierte DNA: Menge und Qualität richten sich nach der gewählten Sequenzierplattform – insbesondere Long-Read-Verfahren stellen andere Anforderungen an Fragmentlänge und Reinheit als Short-Read-Verfahren.

Die Entscheidung ob eine genomweite oder zielgerichtete Analyse empfohlen ist ebenso wie die konkrete Sequenziertiefe werden abhängig von Fragestellung, Probenmaterial und gewünschtem Detailgrad individuell mit Ihnen abgestimmt.

Je nach Fragestellung und Projektstand können weitere Leistungen der Analytical Services relevant sein.